DNA甲基化修飾對于維持植物基因組穩(wěn)定性和調(diào)控基因表達(dá)至關(guān)重要。RNA 聚合酶Pol IV和RDR2是植物RNA-directed DNA methylation通路的重要組成成員。中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心張余團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)Pol IV和RDR2形成一個(gè)雙RNA聚合酶復(fù)合物，并提出了 Pol IV-RDR2復(fù)合物以雙鏈DNA為模板合成雙鏈RNA的“RNA內(nèi)部傳遞”的模型（PMID:?34941388）。在上述模型中，研究人員提出Pol IV首先在基因組DNA上前進(jìn)合成一定長度的RNA，隨后其發(fā)生倒退將RNA從其催化中心傳遞到RDR2催化中心合成雙鏈RNA。該模型的關(guān)鍵步驟是Pol IV在轉(zhuǎn)錄延伸的過程中發(fā)生轉(zhuǎn)錄倒退，從而觸發(fā)Pol IV RNA從內(nèi)部通道進(jìn)入RDR2的催化中心。但Pol IV為什么能夠發(fā)生高效的轉(zhuǎn)錄倒退？這一關(guān)鍵的科學(xué)問題目前尚未闡明。

2024年8月23日，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心張余團(tuán)隊(duì)在Science Advances上發(fā)表題為“Transcription elongation of the plant RNA polymerase IV is prone to backtracking”的研究論文，研究結(jié)果揭示了Pol IV在從Pol II進(jìn)化的過程中，其催化中心發(fā)生變化從而賦予其傾向轉(zhuǎn)錄倒退的特征，進(jìn)一步支持了Pol IV-RDR2復(fù)合物獨(dú)特的“RNA內(nèi)部傳遞”工作模型。

在RNA聚合酶往RNA3’端添加核苷酸延長RNA鏈的過程中，RNA聚合酶催化中心結(jié)合NTP，隨后在其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件的幫助下（catalytic loop, bridge helix和trigger loop）催化磷酸二酯鍵形成、釋放焦磷酸、催化中心移位空出NTP結(jié)合位點(diǎn)。整個(gè)過程叫做核苷酸添加（Nucleotide-addition cycle；NAC）。研究人員解析了Pol IV 的NAC過程中四個(gè)不同狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。通過和Pol II的類似結(jié)構(gòu)對比，研究人員發(fā)現(xiàn)Pol IV在催化 NTP 的過程中其催化中心結(jié)構(gòu)元件發(fā)生不同于Pol II的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致Pol IV具有較弱的NTP結(jié)合能力、較低的催化活性以及較弱的解旋下游DNA活性。綜上這些特征提示Pol IV轉(zhuǎn)錄延伸的過程中具有較弱的往前行進(jìn)能力，傾向于在遇到障礙時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)錄倒退。

RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄延伸過程中一旦發(fā)生轉(zhuǎn)錄倒退，RNA的3’端會占據(jù)NTP結(jié)合通道，從而抑制轉(zhuǎn)錄延伸。細(xì)菌RNAP，古菌RNAP以及高等動植物的Pol I, Pol II和Pol III 其通過自身的水解活性或者轉(zhuǎn)錄校正因子水解backtracked RNA。研究人員通過生化實(shí)驗(yàn)證明Pol IV轉(zhuǎn)錄延伸過程中backtracked RNA能夠很好的被保護(hù)不被降解。研究人員發(fā)現(xiàn)Pol IV具有極低的水解RNA活性，通過解析Pol IV backtracked state的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Pol IV催化中心的結(jié)構(gòu)變化使其不能夠固定backtracked RNA發(fā)生水解反應(yīng)。其次，通過進(jìn)一步生化實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)證據(jù)表明Pol II的轉(zhuǎn)錄校正因子不能作用Pol IV 切割backtracked RNA。以上機(jī)制確保Pol IV backtracked RNA能夠完整進(jìn)入到RDR2催化活性中心，保證雙鏈RNA的高效合成。

中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心張余研究組已畢業(yè)博士研究生方城力和黃坤為該論文共同第一作者，張余研究員為通訊作者。本研究受到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、上海市基礎(chǔ)研究特區(qū)項(xiàng)目資助。

論文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adq3087

Pol IV-RDR2的核苷酸添加循環(huán)示意圖

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