?????2024年 6 月 5日，《The Journal of Neuroscience》期刊以封面文章在線發(fā)表了題為《Tbx2在不同年齡轉(zhuǎn)分化耳蝸外毛細(xì)胞命運(yùn)》的研究論文,該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉志勇研究組完成。該研究探究了轉(zhuǎn)錄因子Tbx2（內(nèi)毛細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因子）過表達(dá)能否轉(zhuǎn)分化不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸外毛細(xì)胞及其前體細(xì)胞，以及其轉(zhuǎn)分化的程度。同時(shí)研究人員還探討了Tbx2與外毛細(xì)胞發(fā)育成熟相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Ikzf2之間的相互拮抗的作用機(jī)制，為深入理解耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞命運(yùn)決定的作用機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。

Tbx2是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞命運(yùn)決定、分化和命運(yùn)維持的關(guān)鍵因子，Tbx2功能缺失導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為外毛細(xì)胞。目前，聽覺領(lǐng)域內(nèi)仍有幾個(gè)關(guān)鍵的問題亟待澄清：1）過表達(dá)Tbx2能否轉(zhuǎn)分化外毛細(xì)胞到內(nèi)毛細(xì)胞？2）Tbx2轉(zhuǎn)分化外毛細(xì)胞是否具有年齡依賴性？3）外毛細(xì)胞中過表達(dá)Tbx2是否可以完全轉(zhuǎn)分化為內(nèi)毛細(xì)胞？4）Tbx2轉(zhuǎn)分化外毛細(xì)胞為內(nèi)毛細(xì)胞的分子機(jī)制是什么？

為了回答以上4個(gè)問題，研究人員構(gòu)建了Tbx2條件性過表達(dá)小鼠模型（簡(jiǎn)稱Tbx2OE），然后分別在新生小鼠和成年小鼠耳蝸外毛細(xì)胞中過表達(dá)Tbx2，發(fā)現(xiàn)均可以把外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為內(nèi)毛細(xì)胞樣的細(xì)胞，并表達(dá)內(nèi)毛細(xì)胞的標(biāo)記物vGlut3、Slc7a14和Otoferlin，同時(shí)伴隨外毛細(xì)胞標(biāo)記物Prestin的漸進(jìn)性消失，說明外毛細(xì)胞對(duì)Tbx2的響應(yīng)不受年齡的影響。在胚胎期外毛細(xì)胞前體細(xì)胞中過表達(dá)Tbx2則直接產(chǎn)生內(nèi)毛細(xì)胞標(biāo)記物Fgf8+和vGlut3+的內(nèi)毛細(xì)胞樣細(xì)胞，無Bcl11b和Prestin表達(dá)（圖1）。同時(shí)，掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，外毛細(xì)胞前體細(xì)胞過表達(dá)Tbx2產(chǎn)生的類內(nèi)毛細(xì)胞的靜纖毛束與內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞相似（圖1），說明細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)越早、細(xì)胞可塑性越高，對(duì)Tbx2的響應(yīng)作用越強(qiáng)。

圖1. 過表達(dá)Tbx2導(dǎo)致外毛細(xì)胞前體細(xì)胞分化發(fā)育為與內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞相似的類內(nèi)毛細(xì)胞。外毛細(xì)胞前體細(xì)胞過表達(dá)Tbx2，產(chǎn)生Fgf8+/ vGlut3+/Bcl11b-/Prestin-的類內(nèi)毛細(xì)胞（D-D’’’和F-F’’’）,而對(duì)照組中則為Bcl11b+/Prestin+/Fgf8-/ vGlut3-的外毛細(xì)胞（C-C’’’和E-E’’’）；掃描電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組（G）中外毛細(xì)胞靜纖毛束為“V”字形，而實(shí)驗(yàn)組（H）中在相應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生的類內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛束和內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞一致，呈“一”字形。黃色箭頭表示轉(zhuǎn)分化的類內(nèi)毛細(xì)胞，藍(lán)色三角形指示內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞。

為了進(jìn)一步探索Tbx2轉(zhuǎn)分化外毛細(xì)胞為內(nèi)毛細(xì)胞的分子機(jī)理，研究人員通過單細(xì)胞Smart-seq對(duì)類內(nèi)毛細(xì)胞、內(nèi)源性外毛細(xì)胞和內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)在類內(nèi)毛細(xì)胞中有85.6%的內(nèi)毛細(xì)胞特異表達(dá)基因出現(xiàn)上調(diào)，同時(shí)38.6%的外毛細(xì)胞特異表達(dá)基因出現(xiàn)下調(diào)，提示Tbx2不能使外毛細(xì)胞完全轉(zhuǎn)分化為內(nèi)毛細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)外毛細(xì)胞發(fā)育成熟關(guān)鍵因子編碼基因Ikzf2受到Tbx2的負(fù)調(diào)控，推測(cè)Ikzf2可能與Tbx2存在于相同的細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控通路，并位于Tbx2的下游，且行使與Tbx2相反的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步證實(shí)該推測(cè)，研究人員構(gòu)建了在外毛細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)Ikzf2和Tbx2的小鼠模型（簡(jiǎn)稱Slc26a5-Tbx2-Ikzf2），確定了Ikzf2對(duì)Tbx2的生物學(xué)功能具有明顯的拮抗作用（圖2）。該研究揭示了Tbx2-Ikzf2模塊對(duì)耳蝸毛細(xì)胞命運(yùn)抉擇的調(diào)控機(jī)制，為將來深入解析該網(wǎng)絡(luò)調(diào)控通路奠定了扎實(shí)的研究基礎(chǔ)。

圖2. 在外毛細(xì)胞中Ikzf2對(duì)Tbx2發(fā)揮了相反的生物學(xué)功能。（A-C’’’）分別為陰性對(duì)照組（A-A’’’）、Tbx2OE（B-B’’’）和OHCs-Tbx2OE-Ikzf2OE（C-C’’’）耳蝸毛細(xì)胞vGlut3、Prestin和tdTomato免疫組織化學(xué)分析；在OHCs-Tbx2OE中tdTomato+細(xì)胞的vGlut3表達(dá)水平與內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞相當(dāng)（甚至略高于內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞），而Prestin則完全消失；相反，OHCs-Tbx2OE-Ikzf2OE中EGFP+的大部分外毛細(xì)胞中vGlut3信號(hào)受到嚴(yán)重的抑制，同時(shí)Prestin信號(hào)則仍有微弱的表達(dá)，說明Ikzf2對(duì)Tbx2的生物學(xué)功能具有拮抗作用；藍(lán)色和黃色箭頭分別指示內(nèi)源性外毛細(xì)胞、Prestin+（弱）/vGlut3- （#1）和vGlut3+（弱）/Prestin-（#2）的細(xì)胞。（D）Ikzf2拮抗外毛細(xì)胞中Tbx2生物學(xué)功能的示意圖。

?????中國科學(xué)院腦智卓越中心劉志勇研究員和副研究員李響為該論文的共同通訊作者，副研究員畢政鴻為第一作者，腦智卓越中心博士研究生任旻蕙、高級(jí)實(shí)驗(yàn)師賀順姬及上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院張宇博士做了重要貢獻(xiàn)。同時(shí)上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院宋雷教授對(duì)本課題電生理內(nèi)容給予了重要的指導(dǎo)。中國科學(xué)院腦智卓越中心光學(xué)平臺(tái)、電鏡平臺(tái)、分子細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)和嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)提供了重要技術(shù)支持。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部、上海市科委和中國科學(xué)院的資助。