4月13日，國際學術期刊Nucleic Acids Research在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周小龍研究組最新研究成果“Activity reconstitution of Kre33 and Tan1 reveals a molecular ruler mechanism in eukaryotic tRNA acetylation”。該項工作首次成功重組真核生物細胞質tRNA乙?；揎椈盍Γ沂疽阴；揎椕笍秃衔?/span>Kre33-Tan1對底物的專一性識別機制，實現(xiàn)tRNA及小RNA分子上的定點高效乙?；揎?。

在細胞內所有RNA分子中，tRNA含有最為密集且種類最為多樣的轉錄后修飾。目前，主要發(fā)現(xiàn)2種RNA乙酰化修飾種類，即N⁴-乙酰胞苷(ac⁴C)及N⁶-乙酰腺苷(ac⁶A)。ac⁴C在三界生物以及病毒來源的多種RNA (包括tRNA、mRNA、rRNA)中均廣泛存在，而ac⁶A只存在于古細菌來源的tRNA中。

上世紀60年代，ac⁴C首先在真核生物的tRNA^Ser和tRNA^Leu以及細菌延伸tRNA^Met (tRNA^Met(e))被鑒定。在細菌tRNA中，ac⁴C特異性地存在于tRNA^Met(e)反密碼子第一位(第34位, ac⁴C34)。ac⁴C34活力重組、結構解析以及遺傳學數(shù)據(jù)表明，TmcA以及TmcAL蛋白質通過兩種不同的機制，分別利用乙酰輔酶A或乙酸作為乙酰供體，催化tRNA^Met(e) ac⁴C34的生物合成。ac⁴C34可以阻止tRNA^Met(e)的CAU反密碼子與異亮氨酸AUA密碼子的配對，防止AUA密碼子被解碼為甲硫氨酸，從而確保了細菌蛋白質合成的精確性。

就真核生物tRNA而言，ac⁴C專一性地存在于第12位(ac⁴C12)。雖然發(fā)現(xiàn)于上世紀60年代，直到2004年，Tan1被發(fā)現(xiàn)參與ac⁴C12形成，但Tan1沒有催化活性中心，普遍認為是一個RNA結合蛋白質。2015年，真核生物tRNA ac⁴C12修飾酶Kre33才被鑒定。Kre33主要定位于核仁，是rRNA前體加工成熟的輔助因子。近年來，人THUMPD1 (Tan1同源蛋白質)系列點突變導致出生缺陷型神經(jīng)發(fā)育異常。但長期以來，真核生物tRNA ac⁴C12修飾從未被成功重組，導致ac⁴C12生物合成的分子基礎、底物識別機制、相關疾病的分子機制等完全未知，也無法基于修飾機器在特定RNA分子上實現(xiàn)定點乙?；揎棥?/span>

在該項研究中，研究人員通過分析核糖體亞基前體剪接復合體中的Kre33結構，并結合AlphaFold預測的Tan1結構，合理設計表達質粒，獲得高純度的Kre33與Tan1蛋白質；通過條件優(yōu)化，利用乙酰輔酶A作為乙?；w，實現(xiàn)tRNA^Ser以及tRNA^Leu上的高效乙?；揎?；系統(tǒng)研究了Kre33-Tan1識別tRNA底物的識別機制，提出了真核生物tRNA乙?；揎椀摹胺肿訕顺摺蹦Ｐ?；在特定tRNA底物上實現(xiàn)100%乙酰化修飾效率，并實現(xiàn)了多種非乙?；?/span>tRNA底物變體的高效乙?；揎?；基于“分子標尺”模型，實現(xiàn)小RNA的位點特異性高效乙?；揎?；進一步通過制備乙酰化修飾的tRNA^Ser以及tRNA^Leu，揭示乙酰化修飾對于tRNA的熱動力學以及氨基?；?jīng)]有顯著影響，可能在翻譯延伸的轉位過程中介導了tRNA與核糖體的相互作用。

該研究首次成功重組真核生物tRNA乙酰化修飾活力并提出了乙?；揎椕笍秃衔?/span>Kre33-Tan1識別底物的“分子標尺”模型，實現(xiàn)tRNA與小RNA分子上的定點高效乙?；揎棥Ｒ陨辖Y果加深了對真核生物tRNA乙?；揎椀姆肿訖C制的認識，并開發(fā)了特定RNA分子定點乙?；揎椆ぞ撸兄谶M一步研究RNA乙?；揎椀臋C制與生物學功能，包括鑒定潛在的乙?；揎椀拈喿x器和擦除器。

分子細胞卓越中心博士研究生馬春蕊為論文第一作者，分子細胞卓越中心/國科大杭州高等研究院周小龍研究員為論文通訊作者。上海交通大學醫(yī)學院許泓教授團隊參與研究。感謝分子細胞卓越中心分子生物學技術平臺李竑博士大力支持。該研究獲科技部、國家自然科學基金委、中國科學院、上海市科委的經(jīng)費資助。

文章鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae262/7645239

真核生物tRNA乙酰化修飾的實現(xiàn)與機制