2024年3月15日,《eLife》雜志在線發(fā)表了題為《Deciphering the genetic interactions between Pou4f3,Gfi1,and Rbm24 in maintaining cochlear hair cell survival》的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉志勇研究組完成。研究團(tuán)隊(duì)通過一系列基因敲除、敲入以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型，揭示了毛細(xì)胞維持存活過程中三個(gè)重要調(diào)控基因Pou4f3、Gfi1以及Rbm24之間的相互作用關(guān)系，確定了Pou4f3而非Gfi1正向調(diào)控Rbm24基因的表達(dá)，并鑒定出3個(gè)之前未知的Rbm24的增強(qiáng)子。同時(shí)，該研究也證明這3個(gè)增強(qiáng)子是在耳蝸毛細(xì)胞有活性，可以用于制備毛細(xì)胞特異的AAV,用于耳聾基因治療。該研究通過扎實(shí)的體內(nèi)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首次闡明了毛細(xì)胞存活必需的新基因Rbm24與其它兩個(gè)關(guān)鍵基因Pou4f3與Gfi1的相互作用關(guān)系，為毛細(xì)胞存活的分子機(jī)制提供了新的見解，并為耳聾治療提供了新的思路與方法。

根據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù)，目前有超過5%的世界人口，即4.3億人（4.32億成年人和3400萬兒童）正遭受聽力喪失的影響，預(yù)估到2050年，患有聽力障礙的人數(shù)將達(dá)到7億人。哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi)僅存數(shù)量有限的毛細(xì)胞，它們是聽覺系統(tǒng)中的重要組成部分。毛細(xì)胞能夠?qū)⒙暡ㄞD(zhuǎn)化為神經(jīng)信號(hào)，最終傳遞給大腦，從而感知聲音。然而，有很多耳毒性因素如基因突變、噪音、藥物、衰老等會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)胞死亡。毛細(xì)胞損傷是導(dǎo)致感音性耳聾的主要原因，一旦毛細(xì)胞受損，它們便無法再生，從而致使聽力發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此，探索維持毛細(xì)胞存活的分子機(jī)制對(duì)于預(yù)防聽力喪失、以及耳聾治療至關(guān)重要。

Pou4f3、Gfi1以及Rbm24都是維持毛細(xì)胞存活所必需的基因。有趣的是，Pou4f3或Gfi1基因缺失的毛細(xì)胞雖然最初可以形成，但隨后會(huì)迅速死亡。相比之下，Rbm24基因缺失的毛細(xì)胞死亡時(shí)間明顯滯后。此外，這3個(gè)基因在耳蝸中的時(shí)空表達(dá)模式非常相似。然而，關(guān)于Pou4f3、Gfi1和Rbm24之間的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制目前知之甚少。該研究通過構(gòu)建一系列基因敲除小鼠模型，結(jié)合免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Rbm24在Pou4f3-/-毛細(xì)胞中的表達(dá)被完全抑制（圖1 A-B’’’），但在Gfi1-/-毛細(xì)胞中的表達(dá)不受影響（圖1 C-D’’）。此外，Pou4f3和Gfi1在Rbm24-/-毛細(xì)胞中的表達(dá)也不受影響（圖1 E-F’’）。這些研究結(jié)果表明：Pou4f3是Rbm24的上游調(diào)控必須基因，而Gfi1與Rbm24互不依賴。

圖1. Pou4f3而非Gfi1是Rbm24的上游調(diào)控基因。A-B’’’. Rbm24在Pou4f3-/-毛細(xì)胞中的表達(dá)完全受到抑制，Bcl11b是外毛細(xì)胞的標(biāo)記基因；A-A’’’. Pou4f3野生型小鼠中Rbm24正常表達(dá)；B-B’’’. Pou4f3敲除小鼠中，毛細(xì)胞正常，但Rbm24表達(dá)完全消失。C-D’’. Rbm24在Gfi1-/-毛細(xì)胞中表達(dá)不受影響，HA是融合在Gfi1末端的標(biāo)簽蛋白，用于表征Gfi1蛋白表達(dá)情況；與Gfi1野生型毛細(xì)胞類似（C-C’’），Gfi1敲除的毛細(xì)胞中Rbm24的表達(dá)未發(fā)生改變（D-D’’）。E-F’’. Pou4f3與Gfi1的表達(dá)不受Rbm24缺失的影響。

進(jìn)?一步，通過分析小鼠耳蝸毛細(xì)胞ATAC-seq與Pou4f3的Cut&Run數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Rbm24基因組上存在3個(gè)能被Pou4f3結(jié)合的順式DNA調(diào)控序列。研究人員通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，確定了這3個(gè)順式DNA調(diào)控序列是Rbm24的增強(qiáng)子，其誘導(dǎo)的綠色熒光報(bào)告基因只在毛細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。最后，研究人員試圖通過回補(bǔ)Rbm24，來緩解或阻止Pou4f3缺失導(dǎo)致的毛細(xì)胞退化死亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僅靠外源性的Rbm24并不能緩解Pou4f3缺失小鼠中毛細(xì)胞的丟失。這個(gè)結(jié)果提示：Pou4f3-Rbm24的級(jí)聯(lián)調(diào)控通路只是Pou4f3的下游調(diào)控通路之一，其他維持毛細(xì)胞存活的Pou4f3下游基因有待后續(xù)研究。

圖2. Pou4f3通過結(jié)合Rbm24的3個(gè)增強(qiáng)子來調(diào)控Rbm24的表達(dá)。A. Pou4f3能夠與Rbm24基因3個(gè)遠(yuǎn)端的順式調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合，A圖上半部分與下半部分分別是IGV軟件可視化毛細(xì)胞ATAC-seq（染色體可及性），以及Pou4f3的Cut&Run（轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA）的結(jié)果。B-G’. Rbm24三個(gè)遠(yuǎn)端的調(diào)控元件(Eh1,Eh2和Eh3) 均能單獨(dú)驅(qū)動(dòng)EGFP在耳蝸毛細(xì)胞中特異性表達(dá)；IHC是內(nèi)毛細(xì)胞；OHC是外毛細(xì)胞；Myo7a是毛細(xì)胞的標(biāo)記基因。

總之，該研究為毛細(xì)胞存活的分子和遺傳機(jī)制提供了新的見解，其中新發(fā)現(xiàn)的3個(gè)Rbm24的增強(qiáng)子對(duì)于耳聾基因治療有很高的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，可用于開發(fā)耳蝸毛細(xì)胞靶向基因治療的新型AAV工具。

中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心劉志勇研究員為本論文的通訊作者，劉志勇組博士研究生王廣琴為本論文的第一作者，博士研究生顧云鵬也為本項(xiàng)目作出了貢獻(xiàn)。中國科學(xué)院腦智卓越中心光學(xué)平臺(tái)和嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)提供了重要技術(shù)支持。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部、上海市科委和中國科學(xué)院的資助。