2024年2月29日，中國科學(xué)院上海藥物研究所徐華強(qiáng)/段佳團(tuán)隊(duì)在Nature Reviews Endocrinology上發(fā)表了題為“Cryo-electron microscopy for GPCR research and drug discovery in endocrinology and metabolism”的研究綜述。該綜述深刻探討了冷凍電鏡（Cryo-EM）在理解和開發(fā)以GPCRs為靶點(diǎn)藥物的革命性影響。文章著重介紹了GPCR配體識(shí)別、受體激活、G蛋白偶聯(lián)、arrestin蛋白募集以及GPCR激酶調(diào)控的一般結(jié)構(gòu)特征和原理。其中，尤其強(qiáng)調(diào)了偏向性配體對(duì)于GPCRs信號(hào)的精確調(diào)控，為治療內(nèi)分泌和代謝疾病的藥物研發(fā)提供了個(gè)性化治療策略的可能性。此外，綜述指出在不同位點(diǎn)受到不同別構(gòu)配體調(diào)節(jié)的GPCRs為藥物開發(fā)和治療策略提供了新的啟示。這一研究對(duì)推動(dòng)內(nèi)分泌和代謝疾病藥物領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)作用。

冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM）的應(yīng)用讓科學(xué)家能夠細(xì)致入微地觀察蛋白質(zhì)微觀傳感器，這不僅讓科研人員更深入地理解人體細(xì)胞之間的通訊機(jī)制，還為激素和藥物反應(yīng)的研究提供了巨大的推動(dòng)力，將為糖尿病、肥胖癥和高血壓病等疾病的藥物研發(fā)帶來革命變革。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是一個(gè)龐大而多樣的跨膜蛋白家族，已知的GPCR受體超過800多個(gè)，在多個(gè)生理過程中（包括內(nèi)分泌代謝途徑）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。作為細(xì)胞表面最大的受體家族，GPCR代表了細(xì)胞與環(huán)境之間的重要接口，能夠?qū)碜酝獠康母鞣N信號(hào)（如光子、味覺、嗅覺、神經(jīng)遞質(zhì)和激素）轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)部的響應(yīng)。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的不斷進(jìn)步，尤其是X射線晶體學(xué)的先驅(qū)，再加上近年來冷凍電子顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展，科研人員對(duì)于GPCR跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的認(rèn)識(shí)日益深刻。值得一提的是，在過去的十年里，冷凍電子顯微鏡技術(shù)的迅猛進(jìn)步徹底改變了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的面貌，為科研人員提供了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，特別是GPCR的深入洞察。自2017年科學(xué)家首次通過低溫電子顯微鏡解析的GPCR結(jié)構(gòu)亮相以來，冷凍電鏡在GPCR研究領(lǐng)域的應(yīng)用迅速擴(kuò)展。

一 冷凍電鏡加速GPCRs信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究

GPCR的激活通過一系列牽涉到多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子的步驟來啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在參與GPCR信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵組分中，G蛋白起著關(guān)鍵作用，它們充當(dāng)分子開關(guān)，負(fù)責(zé)將信號(hào)從受體傳遞到下游效應(yīng)器。根據(jù)Gα亞基的序列同源性，G蛋白可分為四個(gè)亞家族：G_s/olf，G_i/o，G_q/11和G_12/13，每個(gè)亞型都能激活特定的下游效應(yīng)器。G蛋白以其特有的序列同源性細(xì)致地調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)。除了G蛋白，GPCR信號(hào)通路還受到阻遏蛋白（arrestin）和激酶（GRKs）的調(diào)控。Arrestin作為適配體與磷酸化的GPCR相互作用，引發(fā)受體的脫敏、內(nèi)化和啟動(dòng)替代信號(hào)級(jí)聯(lián)。研究表明，GPCR含有與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP），這些變異可能影響受體的激活、脫敏或內(nèi)化過程，從而導(dǎo)致代謝性疾病的嚴(yán)重發(fā)展。GRK對(duì)激活的GPCR進(jìn)行磷酸化，促進(jìn)arrestin的招募，進(jìn)而調(diào)節(jié)GPCR信號(hào)。G蛋白、arrestin和GRK之間的這種相互作用有助于微調(diào)和調(diào)節(jié)GPCR介導(dǎo)的信號(hào)事件。G蛋白和arrestin的偶聯(lián)是調(diào)控GPCR不同生物反應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制，也是GPCR靶向藥物發(fā)揮療效的重要途徑（見圖1）。這些組分之間的動(dòng)態(tài)相互作用確保了對(duì)GPCR信號(hào)的精確時(shí)空調(diào)控，使其能夠協(xié)調(diào)多種生理過程。在GPCR研究的新興領(lǐng)域中，一個(gè)重要方向是鑒定和開發(fā)偏向性配體，它們能夠選擇性地激活或抑制由GPCR介導(dǎo)的特定下游信號(hào)通路。相較于非偏向性配體，偏向性配體通過專門作用于所需的信號(hào)通路，在GPCR藥物發(fā)現(xiàn)中具有明顯的優(yōu)勢。這種精確、有針對(duì)性的調(diào)控方式使偏向性激動(dòng)劑能更有效地發(fā)揮藥理作用，為調(diào)節(jié)GPCR功能提供了一種更為精密的途徑。

圖1 GPCR受體下游不同信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制

在過去的7年里，科研人員見證了GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的顯著進(jìn)展，主要得益于冷凍電鏡技術(shù)的引入，這是一項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，能夠可視化近原子結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。冷凍電鏡技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了對(duì)GPCR的研究，因?yàn)樗軌蛞愿叻直媛蚀_定這些膜蛋白在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，包括與拮抗劑結(jié)合的失活狀態(tài)、無配體的靜息狀態(tài)（apo結(jié)構(gòu)）以及與激動(dòng)劑和別構(gòu)配體結(jié)合的部分或完全激活狀態(tài)，為科研人員理解它們的功能和進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)提供了巨大的潛力。

冷凍電鏡在GPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的杰出成就之一是解析了不同類型GPCR的大量結(jié)構(gòu)。自冷凍電鏡問世以來，通過這一技術(shù)解析的GPCR結(jié)構(gòu)數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長，已超過650個(gè)，超過了X射線晶體學(xué)解析結(jié)構(gòu)數(shù)量的30%以上，自2017年以來通過冷凍電鏡解析的GPCR結(jié)構(gòu)以每0.63年翻一倍（見圖2）。根據(jù)這一進(jìn)展速度的趨勢，科研人員預(yù)計(jì)在未來5-6年內(nèi)，人類整個(gè)GPCR超家族中超過90%的GPCR結(jié)構(gòu)將被解析出來。

除了單個(gè)GPCR結(jié)構(gòu)外，冷凍電鏡還實(shí)現(xiàn)了GPCR與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的可視化。目前已確定了GPCR與不同細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（包括所有亞型的G蛋白和arrestin）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示了GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，冷凍電鏡還幫助揭示了GPCR與GRKs的作用機(jī)制，以及細(xì)胞內(nèi)激動(dòng)劑如何特異性地調(diào)節(jié)GPCR下游G蛋白或arrestin通路的偏向性激活，為偏向性信號(hào)傳導(dǎo)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

冷凍電鏡在解析GPCR結(jié)構(gòu)的速度令人震驚，徹底改變了GPCR的藥物發(fā)現(xiàn)。這意味著科研人員正以前所未有的速度揭示出許多關(guān)于人體關(guān)鍵信號(hào)傳遞的藍(lán)圖，為醫(yī)學(xué)開辟了新的前沿。這預(yù)示著一個(gè)新時(shí)代的到來，在這個(gè)時(shí)代，長期以來困擾人類的疾病將能夠比以往更有效地被治療。站在這個(gè)新前沿的邊緣，冷凍電鏡在增進(jìn)科研人員對(duì)人體的理解和開發(fā)突破性治療方法方面的潛力從未如此顯著。

圖 2 冷凍電鏡實(shí)現(xiàn)對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)解析的革命性突破，加速對(duì)全蛋白質(zhì)組GPCR結(jié)構(gòu)解析，預(yù)計(jì)在未來5-6年內(nèi)，人類整個(gè)GPCR超家族中超過90%的GPCR結(jié)構(gòu)將被解析出來

二 偏向性別構(gòu)調(diào)控藥物是GPCR藥物開發(fā)的重點(diǎn)

深入探究GPCR的結(jié)構(gòu)就如同擁有鎖的詳細(xì)圖紙，使得科研人員能更輕松地設(shè)計(jì)出與之完美契合的“鑰匙”（這里指的是藥物）。這種精準(zhǔn)醫(yī)療方法有望從根本上改變對(duì)一系列疾病的治療方式，為更有效、目標(biāo)更準(zhǔn)確的療法帶來新的希望，同時(shí)降低了副作用的風(fēng)險(xiǎn)。作為細(xì)胞表面受體，GPCR在靠近細(xì)胞膜外側(cè)包含一個(gè)由7次跨膜螺旋構(gòu)成的正構(gòu)配體結(jié)合位點(diǎn)。由于GPCR配體的多樣性（從生物胺等小分子配體到脂質(zhì)、多肽和蛋白），GPCR配體結(jié)合口袋呈現(xiàn)出不同的形狀和大小，每一種配體都具有適應(yīng)相應(yīng)配體的獨(dú)特拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。其中共同的特征是跨膜口袋內(nèi)的一個(gè)關(guān)鍵“切換開關(guān)”殘基（例如，在大多數(shù)A類GPCR中是W^6.48），該殘基的構(gòu)象對(duì)于受體激活至關(guān)重要。激動(dòng)劑的結(jié)合會(huì)引發(fā)W^6.48構(gòu)象的變化，從而誘導(dǎo)跨膜螺旋6（TM6）從非激活狀態(tài)向外移動(dòng)，使受體激活。

GPCR對(duì)G蛋白亞型和arrestin的選擇性主要取決于TM6的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征和受體的磷酸化狀態(tài)。例如，G_s偶聯(lián)的受體在激活時(shí)其TM6會(huì)向外移動(dòng)14-20 埃，而G_i偶聯(lián)受體的TM6向外移動(dòng)7-10 埃。相較于G_i偶聯(lián)受體，G_s偶聯(lián)受體的TM5較長而TM6較短，以適應(yīng)G_s和G_i蛋白表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的不同。除了TM6之外，其他結(jié)構(gòu)元素也有助于G蛋白亞型的偶聯(lián)選擇性。例如，G_q偶聯(lián)受體（如GAL2R）含有一個(gè)獨(dú)特的胞內(nèi)環(huán)2（ICL2），以增強(qiáng)受體與G_q的相互作用。相較之下，G_12/13偶聯(lián)受體（如GPR35）在TM1和TM2胞質(zhì)末端附近含有一個(gè)獨(dú)特的甲硫氨酸口袋，能夠容納G_12/13的C端甲硫氨酸殘基。GPCR招募arrestin的前提是必須被磷酸化并處于活化狀態(tài)，其TM6向外移動(dòng)7-10 埃，與G_i偶聯(lián)受體的活化狀態(tài)相似。GPCR信號(hào)從G蛋白介導(dǎo)的通路向arrestin通路的轉(zhuǎn)換取決于GRKs的功能，GRKs是一個(gè)由七個(gè)成員組成的小型激酶家族。

圖 3 GPCR受體存在多樣的別構(gòu)位點(diǎn)

除了受正構(gòu)配體的調(diào)控外，GPCR還受到別構(gòu)配體的調(diào)控。對(duì)別構(gòu)配體如何影響GPCR信號(hào)的研究可能是冷凍電鏡未來最有價(jià)值的方向之一。例如，目前為治療2型糖尿病（T2DM）而開發(fā)的大多數(shù)GPR40靶向藥物都是基于靠近受體ICL2的別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)。通過觀察別構(gòu)配體結(jié)合的GPCR結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)GPCR存在多個(gè)別構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。這些別構(gòu)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)靶向GPCR的別構(gòu)調(diào)控藥物開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

三 內(nèi)分泌代謝疾病相關(guān)的GPCR靶點(diǎn)成為藥物研究熱點(diǎn)

GPCR已成為代謝性疾病的有望治療靶點(diǎn)，包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎。GPCR參與調(diào)節(jié)關(guān)鍵的代謝過程，如葡萄糖合成、攝取、胰島素分泌和細(xì)胞分化生長。其中，GLP1R、GPR40和GPR120被發(fā)現(xiàn)在人類胰島中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是治療肥胖癥和2型糖尿病的重要靶點(diǎn)。其他GPCR，如GCGR和β-ARs，參與糖代謝、脂質(zhì)合成和糖異生的調(diào)節(jié)。在肥胖病中，GPCR也影響脂肪分解、產(chǎn)熱、葡萄糖管理、脂肪因子和細(xì)胞因子釋放等過程。GPCR一直被認(rèn)為是各種內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病藥物研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)。肽類激素與B類GPCR的結(jié)合效力和選擇性在很大程度上取決于受體的ECD， B類GPCR 的結(jié)構(gòu)解析為設(shè)計(jì)高選擇性或多靶向肽配體提供了詳細(xì)的模板，包括GLP1R、GIPR和GCGR的雙重或三重激動(dòng)劑。

總之，冷凍電鏡的出現(xiàn)深刻推進(jìn)了科研人員對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)和功能的理解，深入了解GPCR偏向性別構(gòu)調(diào)控藥物開發(fā)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有望為內(nèi)分泌代謝性疾病提供更有效、副作用更小的治療方式。

本項(xiàng)研究的第一作者為段佳，通訊作者為徐華強(qiáng)研究員和段佳研究員。本項(xiàng)研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)的支持、上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)等的支持。

作者介紹

徐華強(qiáng)，中國科學(xué)院上海藥物研究所研究員，課題組長，博士生導(dǎo)師，中科院上海藥物研究所藥物靶標(biāo)結(jié)構(gòu)與功能中心主任。主要從事激素受體結(jié)構(gòu)與功能研究和藥物研發(fā)。目前已發(fā)表SCI論文280余篇，其中在CELL,NATURE,SCIENCE主刊論文 38篇，引用次數(shù)超過36,000次，連續(xù)多年被評(píng)為“全球高被引學(xué)者”，并獲得專利十余項(xiàng)。研究成果曾被Science雜志評(píng)為“2009年十大突破之一”、入選“2014年度中國科學(xué)十大進(jìn)展”、入選兩院院士評(píng)選“2015年中國十大科技進(jìn)展新聞”、入選“2019年度中國醫(yī)學(xué)重大進(jìn)展（藥學(xué)部）”和入選中國科學(xué)院上海分院2022年度科技創(chuàng)新“十大進(jìn)展”（基礎(chǔ)研究類）。2016年榮獲國際蛋白質(zhì)學(xué)會(huì)Hans Neurath獎(jiǎng)和“藥明康德生命化學(xué)研究獎(jiǎng)”杰出成就獎(jiǎng)。2019、2021、2022和2023年榮獲中國科學(xué)院優(yōu)秀導(dǎo)師獎(jiǎng)。2020年榮獲上海市“白玉蘭紀(jì)念獎(jiǎng)”。2021年榮獲第十三屆“談家楨生命科學(xué)成就獎(jiǎng)”。2022年榮獲第二十二屆“吳階平-保羅?楊森醫(yī)學(xué)藥學(xué)獎(jiǎng)（吳楊獎(jiǎng)）”。2022年榮獲第九屆“僑界貢獻(xiàn)獎(jiǎng)”一等獎(jiǎng)。2022年榮獲上海市“白玉蘭榮譽(yù)獎(jiǎng)”。

段佳，中國科學(xué)院上海藥物研究所研究員，課題組長，博士生導(dǎo)師。主要從事與代謝相關(guān)GPCR的結(jié)構(gòu)及功能研究。目前已以第一作者兼通訊作者在Nature（3篇）、Nature Communications、Cell Reports等國際知名期刊發(fā)表論文9篇。曾獲得吳瑞獎(jiǎng)學(xué)金，入選中國科學(xué)院上海分院搶占制高點(diǎn)青年攀登計(jì)劃、中國科協(xié)第八屆青年人才托舉工程項(xiàng)目、上?？萍记嗄?5人引領(lǐng)計(jì)劃、上海市青年科技英才揚(yáng)帆計(jì)劃等。課題組常年招聘博士后、科研助理及聯(lián)合培養(yǎng)博士生，歡迎感興趣的老師和同學(xué)聯(lián)系。（duanjia@simm.ac.cn）

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41574-024-00957-1