葉綠體中的光合作用將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，吸收二氧化碳，釋放氧氣，是地球生物圈的重要塑造者。葉綠體大約在15億年前通過藍(lán)藻內(nèi)共生進(jìn)化而來。在進(jìn)化過程中，葉綠體基因要么被廢棄，要么逐漸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核染色體中，導(dǎo)致大多數(shù)陸地植物葉綠體基因組中只保留了110-130個(gè)基因，其中大部分基因編碼基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯和光合作用組分。葉綠體基因組中保存著兩種類型的RNA聚合酶，細(xì)菌型質(zhì)體編碼的RNA聚合酶（PEP）和噬菌體型核編碼的RNA聚合酶（NEP）。

葉綠體PEP在原始質(zhì)體發(fā)育過程中起重要作用，并作為主要的RNA聚合酶在成熟的葉綠體中轉(zhuǎn)錄80%的葉綠體基因。PEP核心（PEP core）保留了細(xì)菌RNA聚合酶類型的結(jié)構(gòu)，包括2個(gè)α亞基、1個(gè)β亞基、1個(gè)β'1亞基和1個(gè)β'2亞基，但不含ω亞基，整體分子量約為450 kDa。PEP的獨(dú)特特點(diǎn)是若干細(xì)胞核編碼真核起源的PEP相關(guān)蛋白（PEP associate proteins，PAPs）與PEP core緊密相互作用，并組裝成一個(gè)分子量約為1 MDa的超復(fù)合物。每個(gè)PAP突變表型與PEP core亞基突變體類似，表現(xiàn)出白化/蒼白等葉綠體發(fā)育缺陷表型。盡管大量工作探索了葉綠體PEP的組成和功能，但是真核起源的PAPs如何與和細(xì)菌起源的PEP core進(jìn)行復(fù)合物組裝、以及如何調(diào)控PEP 的轉(zhuǎn)錄活性，這些問題尚未得到解答。

2024年3月1日（北京時(shí)間），中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心張余團(tuán)隊(duì)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周菲團(tuán)隊(duì)合作在Cell上以“Cryo-EM structures of the plant plastid-encoded RNA polymerase”為題發(fā)表了封面研究論文。研究團(tuán)隊(duì)基于葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功建立了煙草葉片中純化內(nèi)源PEP的方法，解析了葉綠體RNA聚合酶PEP復(fù)合物和PEP轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的亞基組成、亞基組裝方式、特殊功能和功能適應(yīng)性演化，并為進(jìn)一步研究葉綠體中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制和功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

為了純化內(nèi)源性煙草PEP超大復(fù)合物，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因葉煙草，在葉綠體基因組rpoC2基因的3'端插入了一個(gè)編碼串聯(lián)His-Flag標(biāo)簽的DNA片段。隨后利用30-45的天轉(zhuǎn)基因煙草葉子，進(jìn)行親和、離子交換和分子排阻層析等步驟純化，最終得到了高純度的PEP超大復(fù)合物，并具有轉(zhuǎn)錄催化活性。

PEP結(jié)構(gòu)顯示PAP12的結(jié)合位置與藍(lán)藻RNA聚合酶的ω亞基相同，且一級(jí)序列和三維結(jié)構(gòu)高度保守，表明PEP包含一個(gè)完整的細(xì)菌來源RNA聚合酶，構(gòu)成了PEP的“催化模塊”。另外15個(gè)真核起源的PAPs結(jié)合在PEP core外圍，組成了不同的功能模塊，包括“支架模塊”、“保護(hù)模塊”、“RNA模塊”和“調(diào)控模塊”，是目前已知最復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器。 “支架模塊”由七個(gè)亞基（PAP1、PAP3、PAP5、PAP7、PAP8、PAP11和PAP14）組成。與PEP的相互作用界面較大，約占的PEP core表面一半以上，并與PEP core形成了多個(gè)亞基間結(jié)構(gòu)域, 不僅穩(wěn)定了“催化模塊”還為其他模塊提供結(jié)合支架?！氨Ｗo(hù)模塊”由Fe-SOD異源二聚體組成，包含PAP4和PAP9兩個(gè)亞基（也被稱為FSD3和FSD2），通過其超氧化物歧化酶功能，保護(hù)PEP免受葉綠體中超氧化物攻擊?！?/span>RNA模塊”由單個(gè)亞基PAP2組成，結(jié)合在RNA合成通道外圍，以序列特異性的方式結(jié)合RNA，參與并協(xié)助 RNA轉(zhuǎn)錄后加工?！罢{(diào)控模塊”由四個(gè)亞基PAP6、PAP13和兩個(gè)PAP10（也被稱為FLN1、FLN2和Trx z）組成，參與保護(hù)“催化模塊”α亞基的C端結(jié)構(gòu)域，可能參與調(diào)控PEP的轉(zhuǎn)錄活性。這些功能模塊均由細(xì)胞核基因組編碼，其在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體與PEP 的催化模塊形成復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核對(duì)葉綠體基因表達(dá)的控制。

研究團(tuán)隊(duì)最后對(duì)PEP-PAP蛋白亞基進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器PEP-PAP的演化時(shí)間與植物登陸時(shí)間基本一致，陸生植物葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器通過招募這些額外的亞基，演化出獨(dú)特的功能和調(diào)控機(jī)制，幫助其適應(yīng)陸地環(huán)境和特殊的生命周期。

在基礎(chǔ)研究層面，本研究為進(jìn)一步探索葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的工作模式、理解葉綠體的基因表達(dá)調(diào)控方式、以及改造葉綠體基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)打下了基礎(chǔ)。在合成生物學(xué)應(yīng)用層面，本研究為植物葉綠體生物反應(yīng)器的效率提升提供了著手點(diǎn)，助力重組疫苗、重組蛋白藥物、和天然產(chǎn)物的生產(chǎn)。在“碳達(dá)峰”和“碳中和”的雙碳目標(biāo)下，本研究為光合作用系統(tǒng)基因表達(dá)水平的提高提供了新思路，助力植物高效碳匯。

中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心副研究員武霄仙和河南大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生穆文慧（2020級(jí)河南大學(xué)“菁英班”學(xué)生）為該論文的共同第一作者，張余研究員和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周菲副教授為共同通訊作者。該工作還得到了中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心Chanhong Kim研究員的幫助。本項(xiàng)目受到科技部重點(diǎn)研究計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院先導(dǎo)科技專項(xiàng)（B類）項(xiàng)目和上海市基礎(chǔ)研究特區(qū)計(jì)劃的資助。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424000631

葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器構(gòu)造

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