12月12日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與上海市胸科醫(yī)院何奔研究組的最新合作研究成果“Dynamics of Endothelial Cell Generation and Turnover in Arteries during Homeostasis and Diseases”。該項工作利用雙同源重組系統(tǒng)構(gòu)建一種可以長時程不間斷捕捉體內(nèi)內(nèi)皮細胞增殖的技術(shù)，揭示了在穩(wěn)態(tài)、高血壓和糖尿病狀態(tài)下主動脈內(nèi)皮細胞的增殖情況。

　　內(nèi)皮細胞是心血管疾病基礎(chǔ)研究中最重要的細胞之一，其完整性在心血管系統(tǒng)功能維持中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)皮細胞損傷和丟失與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，如高血壓和糖尿病及其并發(fā)癥。內(nèi)皮細胞增殖或內(nèi)皮祖細胞的分化是損傷血管新生內(nèi)皮的主要來源。最早有研究發(fā)現(xiàn)在人外周血中存在內(nèi)皮祖細胞，經(jīng)過分離得到的內(nèi)皮祖細胞在體外可以分化成內(nèi)皮細胞且移植后可以參與新生血管形成。而后有多項研究利用骨髓移植或異體共生的方法，并沒有在小鼠體內(nèi)尋找到骨髓或外周血來源的內(nèi)皮祖細胞。近期的一項研究也進一步否定了人體骨髓細胞中存在內(nèi)皮祖細胞，提示新生血管內(nèi)皮應(yīng)是來自組織原有的內(nèi)皮細胞增殖。最近的譜系追蹤研究表明，損傷后的血管修復(fù)和再生是由內(nèi)皮細胞增殖而來的，且其增殖能力存在異質(zhì)性。依據(jù)體外克隆形成實驗和譜系追蹤，發(fā)現(xiàn)存在一些內(nèi)皮亞群具有更高的增殖能力，如side population、Procr⁺、c-kit⁺、Sca1⁺的內(nèi)皮細胞。但是這些研究大多從分子標(biāo)志出發(fā)，而后驗證表達這些標(biāo)志的細胞都具有內(nèi)皮祖細胞的特性，這也導(dǎo)致了不同研究提出的內(nèi)皮祖細胞標(biāo)志不同，這些細胞是否是同一細胞類群也不清楚。另外，大血管如主動脈的內(nèi)皮細胞增殖率低，同時缺少可靠的細胞增殖記錄方式，導(dǎo)致難以開展尋找主動脈中高增殖內(nèi)皮亞群的研究。同時內(nèi)皮細胞增殖率受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境和血流模式的影響，在高血壓、糖尿病等疾病狀態(tài)下如何變化尚不清楚。基于此，何奔教授團隊從研發(fā)高效標(biāo)記內(nèi)皮細胞增殖的譜系追蹤方法出發(fā)，以尋求在維持血管穩(wěn)態(tài)和疾病中的關(guān)鍵靶點。

　　Ki67是細胞周期標(biāo)記物，可以用于評估組織中發(fā)生增殖的細胞。然而Ki67是瞬時表達在正在發(fā)生增殖事件的細胞，故Ki67報告示蹤鼠可以用于追蹤特定時間點增殖的細胞，但對于主動脈內(nèi)皮這種低增殖率的細胞檢出效果較差?；谥暗难芯?，Dre-rox與Cre-loxP兩種重組酶系統(tǒng)可以在細胞內(nèi)互不干擾共同發(fā)揮作用。研究團隊在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了Ki67-Cre-rox-ER-rox （Ki67-CrexER），經(jīng)Dre重組酶剪切后變成Ki67-Cre，從而實現(xiàn)長時程標(biāo)記Dre重組之后發(fā)生增殖行為的細胞。首先他們構(gòu)建了R26-DreER；Ki67-CrexER；R26-GFP （ProTracer）示蹤鼠，實現(xiàn)標(biāo)記他莫昔芬誘導(dǎo)后所有發(fā)生增殖的細胞。與傳統(tǒng)的Ki67-CrexER；R26-GFP示蹤鼠以及EdU摻入相比，ProTracer鼠在主動脈內(nèi)皮這種低增殖率的細胞具有更高的檢出效率，每個月約有3%的內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖。

　　為了特異性檢測內(nèi)皮細胞的增殖，研究團隊構(gòu)建了Cdh5-DreER；Ki67-CrexER；R26-GFP（EC-ProTracer）示蹤鼠，實現(xiàn)特異性標(biāo)記增殖的內(nèi)皮細胞。與ProTracer鼠結(jié)果一致，隨著時間的延長，發(fā)生增殖的內(nèi)皮細胞越多。從熒光結(jié)果可以看出，增殖行為多為一分二的方式,同時會將兩個相鄰的細胞進行標(biāo)記，作者定義了這種相鄰兩個細胞增殖方向與血流方向的關(guān)系，角度小于 30 定義為平行血流方向增殖，反之為垂直血流方向增殖。有趣的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種增殖行為在主動脈內(nèi)皮多為平行血流方向，在下腔靜脈內(nèi)皮則多為垂直血流方向。

　　先前的研究已表明，血流剪切力感應(yīng)器Piezo1參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞重組以及脈管系統(tǒng)發(fā)育成熟。那Piezo1是否參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮增殖及增殖方向呢?作者在ProTracer示蹤鼠的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Piezo1敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)其主要與主動脈內(nèi)皮增殖方向有關(guān)，與增殖能力及靜脈內(nèi)皮的增殖無關(guān)。

　　如前所述，內(nèi)皮細胞存在異質(zhì)性，增殖能力有差別，本研究的熒光結(jié)果也表明內(nèi)皮細胞增殖能力存在差異。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序可以有效區(qū)分這些存在差異的細胞亞群。作者將穩(wěn)態(tài)條件下誘導(dǎo)標(biāo)記八周的ProTracer鼠進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，將內(nèi)皮細胞提取出來進行亞群分析?；谑欠癖磉_GFP，可以將細胞分為發(fā)生增殖事件的細胞和未增殖的細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC-1亞群（較為特異性表達Ly6C的亞群）具有更強的細胞增殖能力，擬時序分析也發(fā)現(xiàn)這群細胞分化程度更低，同時表達干細胞的標(biāo)記物如Sca1、Sox18等。這些結(jié)果表明Ly6C⁺ EC-1亞群具有內(nèi)皮祖細胞的特征。

　　為了探究影響內(nèi)皮細胞增殖的分子機制，作者發(fā)現(xiàn)VEGFR2（基因名Kdr）在EC-1中具有顯著的表達。也有文章報道Yap1參與內(nèi)皮細胞對機械壓力的反應(yīng)從而引起內(nèi)皮細胞的炎癥，但其是否能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖仍不清楚。故作者在ProTracer鼠基礎(chǔ)上構(gòu)建了基因敲除Kdr或Yap1，發(fā)現(xiàn)分別敲除Kdr和Yap1之后，主動脈和靜脈的內(nèi)皮增殖信號均顯著降低，且在Yap1敲除后Kdr的表達水平也顯著降低，提示Yap1可能部分通過Kdr影響內(nèi)皮細胞的增殖，即Hippo/VEGFR2通路調(diào)控大血管內(nèi)皮細胞的增殖。

　　為了探究主動脈內(nèi)皮細胞在疾病中的變化情況，作者在示蹤鼠的基礎(chǔ)檢測了高血壓與糖尿病模型中內(nèi)皮細胞的增殖情況。有趣的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這兩種慢性病中，內(nèi)皮細胞增殖在高血壓組增加，而在2型糖尿?。═2D）組減少。在T2D中，盡管內(nèi)皮增殖程度是降低的，但是EC-1細胞的增殖能力仍然高于其他內(nèi)皮，如何恢復(fù)這群細胞的增殖分化能力可作為干預(yù)2型糖尿病血管損傷靶標(biāo)。以上研究揭示了穩(wěn)態(tài)和高血壓、糖尿病狀態(tài)下大血管內(nèi)皮細胞增殖的異質(zhì)性，尋找到一群具有高增殖潛能的內(nèi)皮細胞亞群，并探討了影響其增殖的分子機制，為以后預(yù)防高血壓、糖尿病的血管病變提供新思路。

　　上海市胸科醫(yī)院博士后李逸，分子細胞卓越中心博士研究生劉子鑫，上海市胸科醫(yī)院博士后韓溪檬和博士研究生梁楓為該論文共同第一作者。上海市胸科醫(yī)院何奔教授和分子細胞卓越中心周斌研究員為該論文共同通訊作者。該項工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院、上海市及新基石科學(xué)基金等項目資助。

　　文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064301

傳統(tǒng)Ki67示蹤和ProTracer示蹤細胞增殖效率對比