2023年12月15日，國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊New Phytologist在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿研究組聯(lián)合齊魯師范學(xué)院玉米分子育種研究院路小鐸研究組合作完成的題為“Maize DDK1 encoding an Importin-4 protein is essential for seed development and grain filling by mediating nuclear exporting of eIF1A”的研究論文，該研究首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)到了核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與調(diào)控玉米籽粒發(fā)育機(jī)制。

　　玉米（Zea mays）是世界上最主要的糧食、飼料和生物燃料生產(chǎn)作物之一，也是研究籽粒發(fā)育和灌漿的優(yōu)良模式植物。玉米籽粒發(fā)育始于雙受精，即花粉中的兩個(gè)精子分別與卵細(xì)胞和中央極核融合，受精卵發(fā)育為二倍體胚胎而受精極核發(fā)育為三倍體胚乳?？寺『徒馕稣{(diào)控玉米籽粒發(fā)育和灌漿的關(guān)鍵基因，對(duì)提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)指導(dǎo)意義。胚乳發(fā)育和儲(chǔ)藏物質(zhì)合成受到精密的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。目前已報(bào)道了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上直接調(diào)控胚乳儲(chǔ)藏物質(zhì)合成，包括O2、PBF1、OHP、NAC128/130、OHP1/2、ZmbZIP29、ZmABI19、NAC128/130、O11等，但在翻譯水平上的調(diào)控還研究較少。

　　在真核生物中核膜將轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)生物學(xué)過程分隔在不同的區(qū)室。生物大分子的跨膜運(yùn)輸主要由核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)（karyopherin），根據(jù)其轉(zhuǎn)運(yùn)方向不同，可以分為核輸入蛋白（Importin）和核輸出蛋白（Exportin）。在細(xì)胞質(zhì)Importin識(shí)別并結(jié)合底物，通過核孔復(fù)合物（NPC）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)Importin結(jié)合RanGTP后促進(jìn)底物釋放。在細(xì)胞核內(nèi)Exportin結(jié)合RanGTP后促進(jìn)其結(jié)合底物，通過NPC轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)GTP水解為GDP后，促進(jìn)底物釋放。核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其底物在動(dòng)物中得到了大量研究，2022年德國(guó)生物化學(xué)家迪爾克 格爾利希（Dirk Gorlich）教授因其“對(duì)于蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間運(yùn)輸?shù)臋C(jī)理及其選擇性的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)“獲得首屆世界頂尖科學(xué)家協(xié)會(huì)獎(jiǎng)—生命科學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)”，但目前核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中研究較少。

　　研究團(tuán)隊(duì)通過EMS化學(xué)誘變篩選獲得了一個(gè)玉米籽粒突變體，該突變體成熟的籽粒變小，但是能夠完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體從早期胚乳細(xì)胞化到細(xì)胞分化進(jìn)程均延遲，授粉后6天的胚乳細(xì)胞數(shù)目顯著少于野生型。早期胚乳細(xì)胞數(shù)目的多少，對(duì)于成熟籽粒的大小具有決定性的意義，因此我們認(rèn)為突變體籽粒變小的原因是早期胚乳細(xì)胞數(shù)目減少所導(dǎo)致。由于突變體在灌漿期淀粉體和蛋白體的填充進(jìn)程顯著慢于野生型，因此我們將其命名為developmentally delayed kernel 1 (ddk1)。

　　Ddk1編碼植物特異的Importin-4 蛋白，在突變體中該基因上包含一個(gè)SNP，該SNP并沒有影響mRNA表達(dá)水平，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變（G292D），從而能影響了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致在ddk1中不能檢測(cè)到DDK1^G929D的積累。DDK1在單子葉和雙子葉植物中具有保守性，在授粉后不同天數(shù)的籽粒均有表達(dá)。為了探究Ddk1可能參與的生物學(xué)過程，我們對(duì)授粉后不同天數(shù)的籽粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，我們一共篩選到了334個(gè)共有差異表達(dá)基因，其中237個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因，其主要參與了蛋白質(zhì)的合成等生物學(xué)過程。核糖體作為蛋白質(zhì)組裝的機(jī)器，Ddk1突變后導(dǎo)致籽粒發(fā)育延遲卻誘導(dǎo)大量核糖體編碼基因顯著上調(diào)表達(dá)，這可能是由于ddk1蛋白質(zhì)的合成速率降低的一種正反饋調(diào)節(jié)。進(jìn)一步通過多聚核糖體分析和SUnSET證實(shí)Ddk1突變確實(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速率顯著降低。

　　為了探究DDK1是如何在翻譯水平上調(diào)控玉米籽粒發(fā)育，通過酵母雙雜交文庫篩選獲得DDK1的潛在底物，陽性克隆中有80%的基因都編碼eIF1A，進(jìn)一步我們驗(yàn)證了DDK1和eIF1A能夠在植物體內(nèi)相互作用。eIF1A編碼真核生物翻譯起始因子1A，在翻譯起始過程中能夠結(jié)合到40S核糖體上，促進(jìn)其構(gòu)象的改變，進(jìn)一步促進(jìn)起始密碼子的掃描。在動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)，由于eIF1A（16.8 kD）分子量較小，因此能夠自由擴(kuò)散到細(xì)胞核，但是翻譯是被限制在細(xì)胞質(zhì)，因此必須依賴一個(gè)高效的轉(zhuǎn)運(yùn)因子，將細(xì)胞核的eIF1A轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，從而滿足下游翻譯需求。我們發(fā)現(xiàn)DDK1在體外不能直接結(jié)合eIF1A，當(dāng)DDK1結(jié)合RanGTP后，能夠促進(jìn)其識(shí)別并結(jié)合eIF1A。進(jìn)一步我們通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，在野生型中eIF1A主要積累在細(xì)胞質(zhì)，而在ddk1中eIF1A大量積累在細(xì)胞核。說明DDK1充當(dāng)Exportin來介導(dǎo)eIF1A出核轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步在胚乳中特異的敲低eIF1A后，會(huì)導(dǎo)致胚乳的灌漿缺陷，說明eIF1A能夠在翻譯水平上調(diào)控玉米籽粒的發(fā)育。

　　該研究首次克隆并報(bào)到了核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠參與調(diào)控玉米籽粒的發(fā)育，同時(shí)闡明了DDK1/eIF1A模塊作用機(jī)制，為未來分子設(shè)計(jì)育種提供了潛在靶標(biāo)。由于DDK1和eIF1A在不同植物中都非常保守，因此該作用機(jī)制在不同植物中是保守的。

　　中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿研究組博士研究生黃興為該論文的第一作者，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)黃永財(cái)教授、齊魯師范學(xué)院青年教師秦莉等也參與了該項(xiàng)工作。巫永睿研究員與路小鐸教授為該論文的通訊作者。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、中國(guó)科學(xué)院先導(dǎo)科技專項(xiàng)（B類）項(xiàng)目的資助。

　　論文鏈接：http://doi.org/10.1111/nph.19475

圖1 Ddk1成熟籽粒表型

圖2 DDK1介導(dǎo)eIF1A出核轉(zhuǎn)運(yùn)