2023年12月11日,《Development》雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為《In situ  regeneration of inner hair cells in the damaged cochlea by temporally regulated coexpression of Atoh1 and Tbx2》的研究論文。該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉志勇研究組完成。研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞特異性損傷的小鼠模型，并在該模型的基礎(chǔ)上把幼年耳蝸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為新的內(nèi)毛細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)了損傷耳蝸內(nèi)源性?xún)?nèi)毛細(xì)胞后的原位再生，并對(duì)新的內(nèi)毛細(xì)胞進(jìn)行了全面詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，形態(tài)學(xué)和電生理特性等分析。 

　　耳蝸是聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的第一級(jí)聲音感受器，其內(nèi)部的柯蒂氏器官有序排列著三排外毛細(xì)胞、一排內(nèi)毛細(xì)胞及不同類(lèi)型的支持細(xì)胞。內(nèi)毛細(xì)胞負(fù)責(zé)將聲波轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并傳遞給螺旋神經(jīng)節(jié)（聽(tīng)神經(jīng)）。與非哺乳類(lèi)動(dòng)物（如魚(yú)類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)）不同，哺乳類(lèi)動(dòng)物喪失了再生毛細(xì)胞的能力，因此毛細(xì)胞一旦損壞將導(dǎo)致不可逆的永久性耳聾。IBCs/IPhs是耳蝸支持細(xì)胞的兩種亞型，它們與內(nèi)毛細(xì)胞在空間位置上彼此相鄰，并且在發(fā)育過(guò)程中具有相似的細(xì)胞起源。因此，IBCs/IPhs是內(nèi)毛細(xì)胞再生的潛在細(xì)胞來(lái)源和基因操縱靶點(diǎn)(圖1A)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)在新生小鼠耳蝸IBCs/IPhs中條件性地異位過(guò)表達(dá)Atoh1和Tbx2，在正常（沒(méi)有損傷）耳蝸內(nèi)成功地將IBCs/IPhs轉(zhuǎn)分化為vGlut3+新生內(nèi)毛細(xì)胞。但仍有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決：1）在內(nèi)毛細(xì)胞損傷的耳蝸內(nèi)，能否再生出新的內(nèi)毛細(xì)胞？2）新的內(nèi)毛細(xì)胞與野生型內(nèi)毛細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平和電生理特性方面的相似度如何？3）新的內(nèi)毛細(xì)胞能否實(shí)現(xiàn)聽(tīng)力的恢復(fù)或者部分恢復(fù)？ 

　　為解決以上科學(xué)問(wèn)題，研究人員首先構(gòu)建了內(nèi)毛細(xì)胞特異性損傷的小鼠模型Fgf8-DTR/+小鼠模型。當(dāng)Fgf8-DTR/+ 被注射白喉毒素（DT）后，可以導(dǎo)致97.8%的內(nèi)毛細(xì)胞死亡。為了探究損傷野生型內(nèi)毛細(xì)胞能否增加支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為內(nèi)毛細(xì)胞的效率，研究人員構(gòu)建了一個(gè)能夠進(jìn)行精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)的小鼠模型，Plp1-CreER+;Rosa26-Loxp-stop-Loxp-Tbx2-P2A-DHFR*Atoh1*DHFR-T2A-tdTomato/+; Fgf8-DTR/+ (簡(jiǎn)稱(chēng)Plp1-TAT-DTR)，并分為兩組: 1)第一組作為對(duì)照組，僅在P2注射DT (圖1B-B”和圖2A-A’); 2)第二組在P0和P1注射他莫西芬 (TMX)﹑P2注射DT，P3和P4注射甲氧芐啶 (TMP, 用于結(jié)合DHFR，從而瞬時(shí)穩(wěn)定Atoh1的表達(dá))，被定義為TMX/DT/TMP實(shí)驗(yàn)組(圖1C-C”和圖2B-B’)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組有477.0 48.0個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組（17.3 4.0）。并且損傷情況下的新生內(nèi)毛細(xì)胞的再生效率（73.5% 2.3%）顯著高于未損傷的再生效率（29.5% 1.2%，圖1D）。更為重要的是，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析（圖1E）和膜片鉗電生理分析（圖1F-G）表明新的內(nèi)毛細(xì)胞和野生型的內(nèi)毛細(xì)胞具有高度的相似度（達(dá)60%以上），透射電鏡可觀察到新的內(nèi)毛細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生（圖2C-D’）。本研究首次證明了當(dāng)內(nèi)源性內(nèi)毛細(xì)胞受損時(shí)，新生IBCs/IPhs中異位表達(dá)Atoh1和Tbx2，可以再生出新的內(nèi)毛細(xì)胞，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄組和電生理水平上，與內(nèi)源性?xún)?nèi)毛細(xì)胞有60%以上的相似度，并且再生效率比沒(méi)有內(nèi)源性?xún)?nèi)毛細(xì)胞損傷時(shí)有顯著提高。 

　　圖1：A.內(nèi)毛細(xì)胞損傷再生的示意圖；B.內(nèi)毛細(xì)胞損傷小鼠模型可以高效特異的損傷內(nèi)毛細(xì)胞；C.在內(nèi)毛細(xì)胞損傷的情況下，異位表達(dá)Atoh1與Tbx2可再生出vGlut3+的新生內(nèi)毛細(xì)胞；D.損傷情況下的再生毛細(xì)胞效率顯著提高；E.轉(zhuǎn)錄組水平上，新生毛細(xì)胞與野生型P30內(nèi)毛細(xì)胞聚為一群；F-G.新生內(nèi)毛細(xì)胞的電壓依賴(lài)的Ca電流與野生型內(nèi)毛細(xì)胞相似。 

　　為了探討再生出的新生內(nèi)毛細(xì)胞是否具有生物學(xué)功能，研究人員通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)檢測(cè)并比較了Plp1-Ai9（TMX/TMP，陽(yáng)性對(duì)照組）、Plp1-TAT-DTR（DT，陰性對(duì)照組）和Plp1-TAT-DTR（TMX/DT/TMP，實(shí)驗(yàn)組）三者之間的聽(tīng)力，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠的聽(tīng)力未能得到恢復(fù)（圖2E）。為了進(jìn)一步尋找聽(tīng)力不能恢復(fù)的主要原因，研究人員利用電生理技術(shù)，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)毛細(xì)胞不具備機(jī)械敏感電轉(zhuǎn)導(dǎo)通道電流（圖2F-H）。該發(fā)現(xiàn)解釋了新的內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)法感知外界聲音信號(hào)，無(wú)法恢復(fù)聽(tīng)力的原因，從而為未來(lái)如何再生出有功能的毛細(xì)胞提供了方向。 

　　圖2.A-B.掃描電鏡可觀察到在內(nèi)源內(nèi)毛細(xì)胞損傷的情況下，新生內(nèi)毛細(xì)胞可再生出新的纖毛結(jié)構(gòu)；C-D.透射電鏡可觀察到新生內(nèi)毛細(xì)胞有囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生；E.但小鼠聽(tīng)力未能得到有效的改善；F-H.電生理技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)毛細(xì)胞不具備機(jī)械敏感的MET通道電流。 

　　中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心劉志勇研究員與畢政鴻副研究員為本論文的通訊作者，劉志勇組副研究員李響為本論文的第一作者，博士研究生任旻蕙在生物信息學(xué)分析上做了大量工作，博士研究生顧云鵬和研究助理朱彤為本項(xiàng)目做了重要貢獻(xiàn)，上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院張宇博士和腦智卓越中心李杰博士共同完成電生理研究?jī)?nèi)容，腦智卓越中心副研究員李超和王廣琴博士也對(duì)本項(xiàng)目提供了幫助，上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院宋雷教授對(duì)本課題電生理內(nèi)容給予了重要的指導(dǎo)。中國(guó)科學(xué)院腦智卓越中心光學(xué)平臺(tái)、電鏡平臺(tái)、分子細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)和嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)提供了重要技術(shù)支持。該研究獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科技部、上海市科委和中國(guó)科學(xué)院的資助。